sábado, 12 de junio de 2010

TÉCNICAS DE DETERMINACIÓN

1. INTRODUCCIÓN:

En esta última tarea se determinará la concentración de nuestro analito (paracetamol o ácido acetilsalicílico) en la muestra.


Se pueden emplear diversos métodos. Uno de ellos, como ya hemos introducido en la tarea anterior, es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que sirve tanto para separar e identificar los componentes de una muestra (desarrollado en el trabajo previo) como para cuantificarlos (lo cual se correspondería con esta tarea). Así, para determinar la cantidad presente de cada sustancia, se valoran las áreas bajo los picos del cromatograma o la altura de los mismos: sirven para determinar la cuantía de cada componente. El programa informático asociado al sistema HPLC ya nos da estos datos.

Sin embargo, dado que sobre el fundamento del HPLC ya hemos profundizado lo suficiente en trabajos anteriores, hemos decido centrarnos en otros tipos de técnicas de determinación: las técnicas espectroscópicas.


2. DESARROLLO DE LA TÉCNICA: ESPECTROSCOPÍA MOLECULAR ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Usaremos esta técnica debido a su sencillez instrumental y a su amplio rango de aplicación. Como se fundamenta en la absorción de radiación electromagnética por las moléculas de la muestra (siendo la cantidad absorbida proporcional a la concentración de las moléculas que se quieren determinar) debemos hacer que el paracetamol (o el ácido acetilsalicílico) se una a un colorante o bien que cause su activación de tal forma que éste, al absorber en el espectro visible, nos sirva para determinar la cantidad del analito.

Por ejemplo, podemos hacer que el paracetamol se una a un colorante azoico, como la bencidina. Los colorantes azoicos forman parte de una familia de sustancias orgánicas caracterizadas por la presencia del grupo azo (–N=N) como cromóforo, asociados a grupos auxocromo de tipo amino o hidroxilo. Para la bencidina podemos obtener buenos resultados usando una longitud de onda de 495 nm.

Una vez aclarados estos aspectos previos sobre el fundamento de la técnica, procedamos a su desarrollo:


2.1. Elaboración de la recta de calibrado:

Se puede definir calibración como el conjunto de operaciones que se establecen para obtener la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración o masas del conjunto de patrones de calibrado.

Para ello lo más usado es la curva de calibrado, para cuya elaboración se emplean cantidades perfectamente conocidas de analito (disoluciones patrón). En nuestro caso realizaremos, por ejemplo, una serie de disoluciones que contengan 0 mg/ml (el blanco), 3, 6, 9, 12 y 15 mg/ml de paracetamol, respectivamente. A cada disolución le agregaremos también el reactivo de color (no entraremos en detalle en la explicación de estos pasos).

A continuación leeremos en el espectrofotómetro cada una de las disoluciones de concentración conocida a una longitud de onda de 495 nm. Imaginemos que los datos obtenidos fueran los siguientes:



Haciendo la representación gráfica, se observa lo siguiente:


Se aprecia que la relación entre la concentración del analito y la absorbancia es lineal. Ante nuestra muestra problema (la muestra de concentración desconocida que queremos determinar), tras realizar la medida de su absorbancia, ésta se interpola en la recta de calibrado para obtener así la concentración del analito en esa muestra.

Además del método gráfico previamente explicado, también se puede hallar la ecuación de la recta. Para ello usaremos la técnica de regresión por mínimos cuadrados. La recta tendrá una ecuación genérica del tipo y = mx + b, siendo “y” la absorbancia y “x” la concentración del analito (en nuestro caso paracetamol). Para hallar la pendiente de la recta (“m”) usaremos la siguiente fórmula:



Siendo “n” el número de pares de valores. Si sustituimos:



Calculamos ahora el valor de la ordenada en el origen (“b”):


por lo que


Nuestra ecuación de la recta de calibrado sería, pues:



De esta forma, sabiendo la absorbancia de nuestra muestra problema y sustituyendo en la fórmula podremos saber la concentración de paracetamol en la muestra problema. Por ejemplo, si la absorbancia de la muestra cuya concentración de paracetamol desconocemos fuese de 0.236:



mg de paracetamol por ml (también se podría calcular interpolando en la gráfica, pero así es más exacto).


2.2.Determinación de algunos parámetros de calidad del método realizado:

Existen una serie de parámetros cuantitativos que son indicadores de la calidad de las metodologías analíticas. Nosotros hallaremos algunos de ellos:



A) Sensibilidad: expresa la respuesta del instrumento analítico para una concentración determinada de analito.

Un método analítico será más sensible cuanto mayor sea la variación de la señal analítica “y” para una variación de la concentración del analito “x” dada. Por ejemplo, en nuestro caso, si para 3 mg/ml de paracetamol la absorbancia fuese de 0.070 en vez de 0.052, ese otro método sería más sensible.

La sensibilidad viene dada por la pendiente de la curva de calibrado “m”, que en nuestro caso es igual a 0.0176. Cuanto mayor sea, más sensible será el método.



B) Límite de detección (yLOD): Es la mínima concentración de analito que proporciona una señal en el instrumento analítico significativamente diferente de la señal del blanco.

Para determinarlo hay que hacer un total de 30 blancos: obtendríamos 30 señales de absorbancia para el blanco. Imaginemos que esas 30 señales fueron:

· 0.000 nos dio 24 veces
· 0.001 nos dio 5 veces
· 0.002 nos dio 1 vez

La fórmula que nos permite calcular el límite de detección es:

Por lo que si sustituímos:

yLOD = 0.00023 + 3·0.00049 = 0.0017

El resultado viene en forma de señal (absorbancia). Para obtener la concentración habrá que sustituir en la recta de calibrado:

0.0017 = 0.0176x – 0.0008

x = 0.142 mg/ml (esta es la mínima concentración de paracetamol que proporciona una señal en el instrumento analítico significativamente diferente a la señal del blanco).


C) Límite de cuantificación (yLOQ): Expresa la concentración del analito que puede determinarse con seguridad (la mínima concentración a partir de la cual podemos cuantificar). La fórmula que nos permite calcularlo es:

Al sustituir:

yLOQ = 0.00023 + 10·0.00049 = 0.00513


De nuevo, el resultado viene en forma de absorbancia. Para obtener la concentración habrá que sustituir en la recta de calibrado:


0.00513 = 0.0176x – 0.0008


x = 0.337 mg/ml (esta es la mínima concentración de paracetamol a partir de la cual podemos cuantificar con seguridad).